对一例采用ESAT-6和IL-2混合治疗乳腺癌的病例分析

柴敏

上海申普宠物医院

背景

近年来，伴随着宠物犬和猫的老龄化，患肿瘤性疾病的动物数量也在急剧上升。但是，动物的肿瘤治疗方法尚未完全确立，现在针对肿瘤实施的手术、放疗及化疗等治疗的复发几率比较大，治疗后的预后也不太理想。对于难以治愈的恶性肿瘤的特效药来说，遗传基因治疗被寄予很大的期望。

肿瘤细胞之所以可以大量迅速的增殖，有个很重要的原因就是肿瘤细胞的免疫逃逸问题。当一个肿瘤细胞的碎片被树突状细胞（DC）或者其他抗原递呈细胞（APC）吞噬后，无法获取肿瘤细胞的危险信号的抗原，无法将有效的抗原递呈到细胞表面，造成细胞因子不知道如何工作，由于没有特异性抗原刺激细胞因子，因此无法刺激免疫细胞产生特异性免疫，这就造成了免疫逃逸。

目前有两种病毒制剂已被认可，并进入了使用阶段。但是需要使用活病毒来研制这些制剂，处理工序繁杂，并不适合用于动物医疗。

目前使用的主要为腺病毒死亡蛋白(ADP)的致病抗原表达质粒DNA系统。分子量为10500，在感染细胞的核膜表面堆积，当细胞有效溶解释放后代病毒时可以一起复制和传播。而ADP在细胞被吞噬时可以释放危险信号抗原，并被加工递呈至细胞表面，刺激免疫系统。经ADP表达的肿瘤细胞表现出极高的细胞退化。

图1.病毒的机理。

ESAT-6是由结核分枝杆菌毒株（M.Tuberculosis）和牛型分支杆菌毒株（M.Bovis）分泌的低分子量T细胞抗原。它是结核杆菌早期分泌性蛋白质中诱导T细胞免疫反应能力最强的蛋白质。能有效刺激外周血中CD4⁺T细胞增殖和诱导IFN-γ产生。在小鼠感染模型中，ESAT-6特异性T细胞主要是CD45Rblow CD44high LFA-1high L 2selectinlow CD4+ T细胞（可能是一种长效记忆性T细胞），它较易分泌IFN-γ^【1】。

白细胞介素-2（IL-2）被认为是以其强有力的T细胞生长因子活性为基础的，人们广泛认为IL-2是T细胞依赖免疫反应的关键性细胞因子。然而，这种细胞因子主要而重要的功能是调节T细胞免疫耐受性。近来研究指出，CD4⁺CD25⁺调节T（TReg）细胞产生失败，是IL-2缺乏性自身免疫的潜在原因。Thomas Malek的实验证明，IL-2在外周T细胞免疫耐受性中的主要作用是产生TReg细胞。IL-2似乎对免疫反应的后期阶段更重要。专家显示，它对效应细胞的类型和数量起作用，产生和涉及效应细胞在非淋巴组织的迁移或增殖过程中。^【2】

而本实验采用ESAT-6基因重组蛋白和IL-2经特殊工艺重组，能被肿瘤细胞吸收，并在肿瘤细胞内释放危险信号抗原。当DC或APC吞噬该肿瘤细胞后，含有病原抗原的细胞碎片可以被吞噬细胞加工并识别，将特异性抗原递呈到细胞表面，刺激特异性细胞因子正常工作，并诱导MHC I 和MHC II 途径激发特异性免疫，来攻击肿瘤细胞。

IL-2可以进一步调节T细胞，进一步刺激细胞免疫来攻击特异性肿瘤细胞。

图2：本实验的机理：由ESAT-6诱导DC获取肿瘤抗原

使用材料和实验对象

本实验采用的ESAT-6重组基因蛋白和IL-2冻干剂由日本抗结核协会临床医疗实验室、大妻女子大学Yoshiyuki Koyama教授提供。本试剂为三重阴离子复合物，由质粒DNA和聚阳离子混合，并加入聚阴离子和硫酸软骨素，经过冻干、再水合和冷凝后获取。

实验对象为一条雌性马尔济斯犬，13岁，未绝育。在最近一年出现大量乳腺肿块，并由细胞学确认为腺癌细胞，由于肿块过多过大，主人不愿意手术治疗，经主人同意采用ESAT-6+IL-2混合物进行注射治疗。检查报告及肿块照片见下图。

图3，该犬注射前的血液检查报告，显示有贫血和轻度肝脏异常。

2012年3月23日

仰卧示意图

○ 无明显肿块

●  肿块

         ○         ●50px*50px       ○           ○                   

头                                                                尾

         ●125px*75px  ●75px*62.5px     ●62.5px*75px  ●150px*100px

图4,3月23日右侧最后一个肿块，6*100px

图5，穿刺细胞学，见腺癌细胞。                  图6，穿刺细胞学，见腺癌细胞。

（H.E染色  100倍镜下）                         （H.E染色 400倍镜下）

实验方法

剃毛，皮肤用碘酒消毒并脱碘。

用5ml 5%葡萄糖溶液(GLU)溶解冻干剂，并注射入肿块内，每周一次，注射6周为一个疗程。

实验结果

2012年4月27日

仰卧示意图

○ 无明显肿块

●  肿块

                        （注射）                                (未注射)

       ○              ●50px*50px       ○               ●42.5px*42.5px

头      （注射）         （注射）        （注射）          （注射）             尾

       ●125px*75px       ●62.5px*45px   ●62.5px*50px      ●100px*75px

图7，4月27日右侧最后一个肿块照片，大小为4*75px，明显缩小。

图8,5月11日血检报告显示，肝脏恢复，显示该药物无任何肝肾副作用。

该主人经过继续的两周注射后，采取手术治疗，之后未进行该药物治疗。

结论。

ESAT-6+IL-2对于腺癌的治疗有明显的效果，且未见明显不良副作用。

讨论。

1. 目前肿瘤已经成为小动物临床上最常见的老年病之一了。而目前对于肿瘤的治疗方法，仅限于手术切除。不可否认这是目前唯一而且是最有效的方法，但是对于某些特定疾病比如糖尿病、慢性肾衰竭、充血性心力衰竭的老年动物，这个方法并不是最适合的，虽然肿瘤可以切除，但是动物的生活质量或者生命则会由于手术的风险而受到极大的影响。因此，采用药物治疗肿瘤的方法在老年犬中可能更适用。

2. 由于肿瘤存在一定的免疫逃逸问题，而本实验中进行的正是解决这种免疫逃逸问题的方法，在初步的实验结果下来，该药物对于免疫逃逸有明显的抑制作用，但是由于仅针对乳腺癌的病例进行了实验，而且样本容量并不大，因此还需要进一步的临床试验来获取更多的数据。

3. 人医采用的化疗药物或者其他靶向药物，要不就是副作用非常大，或者价格极为昂贵，如果一旦本次实验的结果证实了ESAT-6+IL-2可以明显抑制免疫逃逸问题，促使机体的免疫系统识别出异常的肿瘤细胞，来进行免疫应答，那么这种治疗方法将是没有副作用的，其次，这类药物的成分比较简单，价格也不是很昂贵，因此在将来，这将是一种很有潜力开发的药物种类。

参考文献

【1】Hans J M,Daniela GT, Peter A,et al.Protective efficacy against tuberculosis of ESAT-6 sevreted by a live Salmonella typhimuri um vaccine carrier strain and expressed by naked DNA[J].Vaccine 2000,19:4028-4035.

【2】Thomas R.Malek,Allison L.Bayer. Tolerance,not immunity,crucially depends on IL-2[J].Nature Reviews Immunology 2004,4:665-674.