犬眼球甘油冷冻保存的试验研究

摘要：为了探讨犬全眼球甘油冷冻保存角膜的效果，本试验通过摘除犬新鲜眼球，经无菌甘油4℃预脱水24h，转入-20℃甘油冷冻保存，分别与5、10、20、30d进行复温复水，对角膜内皮行台盼蓝-茜素红染色并光学显微镜检查以检验保存效果。试验结果显示保存5、10d角膜内皮细胞轮廓清晰，但核蓝染；20d细胞轮廓模糊，仅见核蓝染；30d细胞轮廓模糊，核蓝染并出现溶解区。说明该保存眼球的方法并不能长期保存，但是20d内角膜内皮细胞仍具有活性。

关键词：犬；眼球；甘油；冷冻保存

An Experimental Study onCanine Whole Eyeball Preservation with Freezing

Wuming Li

  Shanghai shenpu xiangxieyuananimal hospital; Shanghai；2000050

Abstract：To investigate the effect of canine cornea preserved by whole eyeballwith glycerol, canine fresh eyeballs were pre-dehydration sterile with glycerolat 4 ℃ for 24h, and stored in glycerol storage solution at -20℃ freezer. Theeyeballs got rewarming and rewatering at 5, 10, 20, 30 d, and endotheliums wereexamined by trypan blue combined with alizarin red staining and opticalmicroscopy．The results showed that cornealendothelial cells outline were clear, but the nucleus stained blue at 5,10d;corneal endothelial cells blured, just see the nuclear stained blue at 20d;corneal endothelial cells blured and the emergence of the nuclear blue dyedissolved district at 30d. Conclusion: The results prove that the method can’tbe used for long-term preservation, but the corneal endothelial cells stillactive for 20 days.

Key words：canine;eyeball；glycerol ;freezing storage

1  前言

角膜移植术使千万眼疾患者重见光明，伴随此项手术一同发展的是角膜保存技术，因为角膜保存的质量与时间是决定手术效果的关键随着角膜移植手术的发展，角膜保存技术也逐渐改进。传统的4℃ 全眼球保存法，具有简便、价廉等优点，但保存时间短，一般定为24h之内移植。深低温冷冻保存法^{[1 2]} ，虽能长期保存角膜内皮细胞活性，但由于是采用游离角膜片保存，内皮细胞直接暴露，容易受各种机械和理化因素的损伤，且操作技术复杂，植片不易取材，仪器、设备也非常昂贵，尚不能广泛开展。本试验设计了一种简单、经济切实可行的犬眼球低温冷冻保存的方法，通过观察不同时间的犬眼角膜内皮细胞的形态学的改变，来评价角膜内皮细胞的活性。为临床上长期保存眼球角膜寻找一种实用的方法，为穿透性角膜移植所需的角膜材料奠定基础。

2　材料与方法

2.1　材料

2.1.1试验动物  健康杂交犬10只体重3-5kg、2-3月龄、眼睛无疾病和眼病史。

2.1.2试验仪器及器械

立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂型号：YXQ-LS-30SLL）、组织剪、毛剪、镊子、止血钳、眼科镊、眼科剪、角膜剪、保定绳、烧杯、一次性注射器。

2.1.3试验试剂及药品

丙三醇（重庆川东化工<集团>有限公司 20020611）、生理盐水（太极集团西南药业股份有限公司 10021013）、0.1%台盼兰、0.2%茜素红、硫酸庆大霉素（太极集团西南药业股份有限公司 090805）、速眠新Ⅱ注射液（军需大学兽医研究所 2004005013）。

2.1.4无菌甘油制备

无水甘油121℃高温消毒2小时后以广口瓶分装,每瓶装40mL置于4℃冰箱内备用^[3]。

2.2  眼球保存

2.2.1器械及与试剂准备

将手术器械用纱布包好后用高压蒸汽消毒（121℃ 30min）。准备好无菌的烧杯，里面盛满庆大霉素的生理盐水2000U/ml，灭菌无水甘油。

2.2.2眼球的处理

术犬按0.08~0.1ml/kg肌肉注射速眠新^[4]完全麻醉以后静脉注入空气致死。用毛剪将眼睛周围的毛全部剪干净。先用碘酊消毒然后再用酒精消毒。在无菌条件下手术方法将眼球取出后放入盛满庆大霉素生理盐水2000U/ml的烧杯中。

2.2.3眼球保存

将眼球放入准备好的无菌甘油中4℃预脱水24h后，然后再转入另一个甘油瓶中-20℃保存^[5]

2.3  复水、复温、复形

分别在5d、10d、20d、30d将眼球从甘油中取出眼球4颗，在庆大霉素生理盐水（2000U/ml）溶液中（复水、复温）20min,将稀释的庆大霉素溶液自视神经残端注入眼内,恢复正常眼压，小心取下角膜片。用眼科镊夹起角膜在生理盐水中轻轻漂洗后内皮向上放置在玻片上。

2.4  台盼蓝-茜素红联合染色

将角膜在盛有生理盐水的瓶皿中轻轻漂洗3次，将角膜内皮朝上置于凹形角膜台上，滴人0．25％台盼兰染色5min，用生理盐水漂洗1~3次洗去台盼兰，再用0.2%茜素红染色5min^[6]，生理盐水漂洗1～3次洗去，将角膜内皮朝上，置于载玻片上，显微镜下观察角膜内皮细胞核的形态和着色情况并照像。

3  试验结果

3.1　正常角膜内皮形态

正常新鲜角膜内皮细胞经茜索红染色后，呈六角形、镶嵌型排列；台盼蓝复染，则核呈肾形或蚕豆状，淡蓝色(图1)。

3.2保存5天的角膜内皮形态

角膜内皮细胞经茜素红染色后，仍可见六角形边界和镶嵌型排列；台盼蓝复染后，其核呈蚕豆状淡蓝色，分布密度和正常新鲜角膜内皮细胞染色后核的分布基本一致（图2）。

3.3　保存10天的角膜内皮形态

角膜内皮细胞边界清晰可辨，部分细胞出现萎缩（图3）。

3.4　保存20天的角膜内皮形态

角膜内皮细胞边界模糊不清，仅见蓝染的细胞核（图4）

3.5保存30天的角膜内皮形态

可见细胞脱落区以及细胞形态模糊、核明显蓝染的细胞溶解区（图4）

4  分析与讨论

台盼蓝是一种生物细胞的活性染料,主要对细胞核发生着色反应,细胞浆不着色。茜素红是一种神经组织的活性染色剂，依赖细胞间隙中钙的红染反应，而可清晰地展示出具有活性内皮细胞的形态，对细胞核不染色。

细胞在冷冻状态下，代谢几乎停止，生命以相对静止状态保持下来，所以，从理论上讲，冷冻细胞的有效保存时间是无限的。然而冷冻也能对细胞造成不可逆性损害，其损害机制比较公认的是玻璃态假说。该假说认为，在缓慢降温或升温时，水分子会有序排列形成冰晶，而冰晶化是造成细胞不可逆性死亡的主要原因。因此，冷冻保存的关键是通过快速降温或升温，使水分子原位冻结成玻璃态或由玻璃态直接液化，从而避免冰晶的形成。目前所采取快速降温和升温措施，还达不到完全玻璃化的程度，所以，在细胞冷冻过程中，需采取添加甘油等抗冻物质的措施来增强细胞抗冻能力。甘油属多羟基化合物，每个分子有三个羟基(-OH),羟基与水形成氢键，因此甘油具有很强的亲水性，可以轻易渗透至细胞内限制和干扰细胞内外的蒸汽压相近，从而降低细胞的冰点，从冰晶化危险温度区的上限缩短危险温度区；另外，甘油深入细胞内部，置换出细胞内的游离水和一些盐类，减轻了电解液浓度增加带来的不良影响；甘油还可保护细胞内的一些重要酶类免受冻害而逸出，从而保证解冻后细胞的活性；此外，甘油是很好的溶剂，易清洗，并具有抑菌作用^[7]。在-20℃条件下，细胞始终处于结晶化温度区，通过快速降温或升温的方式难以减少冰晶的形成，因为，需采取措施充分减少细胞内外水分或使用冷冻保护剂阻止冰晶的形成。因此，本试验采用4℃预脱水24h，然后转存于-20℃下冷冻保存。试验结果显示，保存5d以后的角膜开始出现蓝染，10d的角膜虽然有一定的细胞密度但内皮细胞已经开始出现萎缩蓝染变深，但细胞轮廓清晰可辨。保存20d的角膜，内皮细胞边界模糊不清，但可见蓝染的细胞核。马吉献^[8]报道细胞轮廓不见, 但细胞核仍然存在的保存角膜内皮细胞,并非真正的死亡细胞，虽有内皮细胞破坏，但绝大多数内皮细胞保存了活性。30d的角膜可见细胞脱落区以及细胞形态完全模糊不清、核明显蓝染，细胞出现溶解区，说明内皮细胞已出现死亡现象。

5  结论

本试验采用4℃甘油预脱水24h，然后转存于-20℃下甘油冷冻保存全眼球，20天左右内皮细胞仍有活性，但30天细胞出现死亡，因此，我们认为该保存眼球的方法并不能长期保存，但是20d内角膜仍然具有活性。

参考文献：

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[6]马吉献，张廷钱，于纯智用茜素红一锥蓝联合染色法对兔角膜内皮细胞活性的评价［R］．眼科研究1993，第11卷第1期．

[7]中国农业大学．家畜繁殖学．第3版．北京：中国农业出版社，2000：160-168．

[8]马吉献，张廷钱，于纯智用茜素红一锥蓝联合染色法对兔角膜内皮细胞活性的评价［R］．眼科研究1993，第11卷第1期．